شماره تلفن : 09307584802

خانه ژورنال دانشجویان ایران

Iranian Students Article House

آغازگرهای تازه توسعه یافته برای تشخیص مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه های پاراتوبرکلوزیس

 

Newly developed primers for the detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2004.02.006

June 2004

Abstract

Recent publications reported the existence of IS900 like sequences in mycobacteria different from Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). The primers used for IS900 detection of Map have amplified these sequences causing false positive results. In this study, we have developed two new PCR assays for the detection of Map. The first assay is based on the IS900 sequence using primers different from the ones previously reported, the second assay on the f57 sequence. The specificity of the tests was checked by analysis of 190 mycobacterial isolates (74 Map and 116 non-Map isolates). All Map strains were positive and all non-Map strains were negative. Serial dilutions of Map bacteria were used to assess the sensitivity of the assays. We achieved a sensitivity of 1 CFU per PCR for both assays. In addition, a PCR-simulating computer programme was used to evaluate the specificity of the new IS900 primers.
The combination of the two PCR assays has proven to be useful for the identification of Map but validation on a large range of clinical samples still needs to be done

Keywords: Paratuberculosis, PCR, IS900, Mycobacterium avium, f57

 

دانلود مقاله انگلیسی

 

آغازگرهای تازه توسعه یافته برای تشخیص مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه های پاراتوبرکلوزیس

چکیده
نشریات جدید، وجود توالی IS900 را در مایکو مایکوباکتریوم مختلف از مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه های پاراتوبرکلوزیس گزارش دادند .آغازگرهای مورد استفاده برای تشخیص mapIS900 ، این توالی را تقویت کرده اند که باعث نتایج مثبت کاذب شد . در این مطالعه ، دو روش جدید PCR را برای تشخیص map توسعه دادیم. روش اول بر اساسIS900 توالی با استفاده از آغازگرهای مختلفی که قبلا گزارش شده بود و روش دوم بر اساس f57 توالی استوار است. ویژگی این آزمون ها با تجزیه و تحلیل ۱۹۰ نمونه مایکوباکتریال مورد (۷۴ map و ۱۱۶ نمونه غیر map ) بررسی قرار گرفت. تمام map ها سویه های مثبت بودند و همه گونه های غیر map منفی بودند . رقت های باکتری map برای ارزیابی حساسیت روشها مورد استفاده قرار گرفت . ما به حساسیت ۱ CFU در هر PCR برای هر دو روش دست یافتیم. علاوه بر این، یک برنامه شبیه ساز کامپیوتر PCR به منظور بررسی ویژگی IS900 آغازگر جدید مورد استفاده قرار گرفت . ترکیبی ازدو روش PCR برای شناسایی map موثر واقع شده اما اعتبار طیف وسیعی از نمونه های بالینی هنوز باید بررسی شود .
کلیدواژه: پاراتوبرکلوزیس، PCR، IS900;، مایکوباکتریوم اویوم، f57

۱) مقدمه
بیماری پاراتوبرکلوزیسیا Johne یک بیماری مزمن و علاج ناپذیر از حیوانات اهلی و وحشی (به خصوص نشخوارکنندگان ) است که از عفونت مایکوباکتریوم avium زیرگونه پاراتوبرکلوزیس( map ) ناشی میشود . لاغری ، کاهش تولید شیر ، ادما ، کم خونی ، ناباروری و در نهایت مرگ ، علائم غالب در مرحله آخر این بیماری است . تعداد زیادی از ارگانیسم های map ممکن است در مدفوع قرار گرفته باشد ، در نتیجه محیط زیست را آلوده میکند . استفاده از روش های مولکولی برای تشخیص پاراتوبرکلوزیس، تحت توسعه و ارزیابی پایدار قرار گرفته است . تعدادی از ژن ها و توالی های منحصر به فرد map در طول سال ها شناسایی شده اند . توالی IS900 در اواخر دهه ۱۹۸۰ کشف شد . این قرار گرفتن توالی یک قطعه ۱۴۵۱ bp است که فاقد گزارش های ترمینال معکوس است و ۱۵ تا ۲۰ مرتبه در ژنوم map تکرار شده است . توالی f57 برای عامل بیماری Johne نشان داده شده و در هیچ گونه ای از گونه های مایکوباکتریال یافت نشد. این یک قطعه ۶۲۰ bp با محتوای G + C 58.9 ٪ است.
قرارگیری IS900 عنصر به طور معمول برای تشخیص حضور map مورد استفاده قرار میگیرد . استفاده از روش PCR برای تشخیص ، گسترده است : تشخیص IS900 بافت فیکس شده در فرمالین و جاسازی شده در پارافین پس از محیط رادیومتری BACTEC 12B ، در نمونه های تجاری از شیر فله و در بیوپسی های روده انسان . با این حال ، map بسیار مرتبط به موجودات زنده و شایع زیست محیطی پیچیده M. avium ، به خصوص زیرگونه M. avium است . ۹۷ ٪ همولوژی DNA در میان map و M. avium زیرگونه avium گزارش شده است. توالی های مربوط به IS900 همچنین در pigeon wood مایکوباکتریوم ( IS902 ) avium زیرگونه avium ( IS901) یافت شد . توالی های درج شده IS1626 ( موجود در M. avium زیرگونه avium و M. intracelluare ) مرتبط با توالی پ IS900 است . نشان داده شده که برخی گونه های مایکوباکتریوم شامل توالی های DNA با شباهت قابل توجهی به توالی IS900 است . آغازگرهای گزارش شده در این مقاله توسط واری و همکارانش به طور گسترده ای در چندین مدل از آزمون IS900 PCR مورد استفاده قرار گرفته است . با استفاده از این آغازگرها ، کازینز و همکارانش یک قطعه PCR از محیط زیست مایکو باکتریا را گزارش دادند ، که می تواند نتایج مثبت کاذبی را نشان دهد که به دست آمده از گونه های دیگر map هستند . Englund و همکارانش به توصیف مایکوباکتریوم حاوی یک کپی از یک توالی است که ۹۴٪ هویت IS900 را در سطح اسید نوکلئیک نمایش میدهد . این داده ها نشان داد که نتایج PCR بر اساس توالی IS900 باید با احتیاط تفسیرشوند . آغازگرهای مورد استفاده کنونی IS900 ممکن است برای map به عنوان IS900 عناصری که ممکن است با مایکوی دیگر مرتبط باشد خاص نباشند. کازینز و همکارانش (۱۹۹۹) پیشنهاد کردند که بررسی محدودیت ها باید برای تایید مشخصات توالی داخلی محصول باشند . با این حال Englund و همکارانش در سال (۲۰۰۲) به شناسایی مایکوباکتریوم SP (2333 نژاد) باIS900 توالی از قسمت های محدودی پرداختند که بعد از تقویت با منشا آغازگرهای p90/91 و ۱۵۰ / ۹۲۱ به قسمت های محدود در DNA تقویت شده map یکسان بودند . بنابراین ، تجزیه و تحلیل محدودیت endonucleasis ، مشکل مثبت های کاذب را حل نکرد . Englund و همکارانش توصیه می کند که یک IS900 PCR مثبت باید توسط توالی های بعدی و یا توسط روش PCR با هدف قرار دادن ژن دیگری در map تایید شود . در این مطالعه ، دو آغازگر جدید توسعه یافته PCR بر اساس درج توالی IS900 و و توالی منحصر به فرد f57 توسعه و ارزیابی شدند . توالیهای نوکلئوتیدی این آغازگرها از نظر ویژگی ها متفاوت از آغازگرها یی هستند که قبلا گزارش شده اند .

۲ مواد و روش ها
۲٫۱ ایزوله های باکتریایی
ایزوله های مایکوباکتریال از مجموعه آزمایشگاه بلژیکی مایکوباکتریوم مرجع ) موسسه طب گرمسیری ، آنتورپ، بلژیک ) مورد استفاده قرار گرفت . نمونه های map در جدول ۱ ونمونه های جدا شده غیر map در جدول ۲ ذکر شده است. ایزوله های map در دامنه های محیط اصلاح لویناشتاین با مایکوباکتین (۱ mg / L) J ، PANTA به علاوه (۴۰ میلی لیتر(پیروات سدیم (۴ گرم( L/ ، تکمیل و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد رشد داده شدند . نمونه های غیر map در محیط لویناشتاین Stonebrink (M. بوویس ) ، اوگاوا با سیترات آمونیوم آهن (۱٫۵٪ m) (M. haemophilum ) Middlebrook 7H11 ( genavense ، کورینه باکتریوم SP کشت داده شدند . تمامی گونه های باکتری و مایکوباکتریال ها با استفاده از آزمون های کلاسیک بیوشیمیایی و / یا مولکولی شناسایی شدند .

۲٫۲ : استخراج DNA ژنومی
یک حلقه از سلول های باکتریایی در ۶۰۰ L از بافر اختلال ( ۴M گوانیدین تیوسیانات بیوشیمیایی ICN ، کوستا مسا ، CA ، سیترات سدیم ۰٫۰۲۵ ) (۷ pH ) ، ۰٫۵ ٪ sarkosyl (سیگما ، سنت لوئیس، MO ) ، ۰٫۱M2 مرکاپتو اتانول (سیگما) ، ۲۰ mMEDTA 8 pH (سیگما ( معلق شدند . ششصد میکرولیتر از مخلوط PCI به بافر اختلال اضافه شد و با گرداب به مدت ۵ ثانیه مخلوط گردید . پس از سانتریفیوژ در ۱۲۰۰۰ g × به مدت ۵ دقیقه ، فاز آبی بالا به لوله جدید منتقل شد و باحجم مساوی از مخلوط PCI ترکیب شد . نمونه با گرداب مخلوط شد و در ۱۲،۰۰۰ g × به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژشد . فاز آبی بالا به لوله جدید منتقل شد و با ۱٪ از کلروفرم : isoamylalcohol ( 24:1 ) مخلوط شد . پس از سانتریفوژ ، فاز آبی به یک لوله جدید به به دنبال بارش DNA در ٪ ۳M استات سدیم و ۱ ٪ حجم ایزوپروپانول سرد ۰٫۱ منتقل شد.. در طول ۱۰ دقیقه پس از سانتریفیوژ درگرم× ۱۲۰۰۰ ، مایع رویی دور ریخته شد. پلت ابتدا در یک exsiccator خشک شد و پس از آن در ۱× TE 10میلیمولار تریس هیدروکلراید pH برابر ۸) ، ۱ میلی مولار حل شد EDTA. غلظت DNA استخراج شده با GeneQuant )Amersham Pharmacia زیست فناوری ، اوپسالا ، سوئد ) اندازه گیری شد.

PCR : 2.3

الیگونوکلئوتیدها بر اساس f57 و توالی های IS900 طراحی شدند . این توالی ها ، مکان شان در درون ژن های مربوطه و اندازه پیش بینی شده محصولات PCR برای این آغازگرها در جدول ۳ خلاصه شده است. تقویت هر دو جایگاه بر اساس رویکرد روشهای PCR استوار است . آغازگرهای S1 IS900 و IS900 R3 (2) ابتدا برای اجرای تقویت IS900 و آغازگرهای R57 و F57 برای f57 PCR مورد استفاده قرار گرفت . IS900 R1 و IS900 S2 به عنوان آغازگرهای تو در تو برای IS900 و F57 و F57n برای توالی f57 مورد استفاده قرار گرفت PCR. های اولیه در حجم نهایی ۲۵ L ظرف حاوی ۱۰ میلی مولار تریس هیدروکلراید (با pH برابر ۸٫۳)، ۵۰ میلی مولار KCl، ۱٫۶ میلی مولار MgCl 2، ۲۰۰ M از هر dNTP، PM 20 برای اولین بار، ۰٫۵U taqپلیمراز Eurogentec) و Silverstar وSeraing، بلژیک) و ۵ میکرو لیتر عصاره DNA باکتریایی انجام شد . لوله ها در ترموسایکلر ، قرار گرفت و تقویت بشرح زیر صورت گرفت : یک سیکل دناتوراسیون در ۹۴ ◦ C به مدت ۴ دقیقه بدنبال ۴۰ سیکل دناتوراسیون در ۹۴ به مدت ۴۵ ◦ C و یک ، بازپخت در ۶۸ درجه سانتیگراد به مدت ۴۵ ثانیه و گسترش در ۷۲ درجه به مدت ۴۵ C، و در فرمت پایان در ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه بود PCR . ثانویه در حجم نهایی ۲۵ میکرو لیتر حاوی ۱۰ میلی مولار تریس هیدروکلراید (با pH برابر ۸٫۳)، ۵۰ میلی مولار با KCl، ۱٫۶ میلی مولار MgCl 2، ۲۰۰M از هر dNTP، ۲۰ pm از هر پرایمر، ۰٫۵U پلیمراز taq و ۱ میکرومتر از اولین محلول PCR انجام شد .لوله ها در ترموسایکلر ، قرار گرفت و تقویت به شرح زیر بود: یک سیکل دناتوراسیون در ۹۴ ◦ C به مدت ۴ دقیقه در ۹۴ به مدت ۴۵ ◦ C و پس از ۲۵ سیکل دناتوراسیون، بازپخت در ۶۸ درجه سانتیگراد به مدت ۴۵ ثانیه و گسترش در ۷۲ درجه به مدت ۴۵ C، و فرمت در پایان در ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه بود . مخلوط PCR با آب به عنوان الگو به عنوان کنترل منفی مورد استفاده قرار گرفت . DNA باکتریایی مرجع سویه map ATCC 19698 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. نتایج PCR توسط الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۲٪ (W / V) رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید مورد بررسی قرار گرفت و توسط نور ماوراء بنفش ترانس دیده شد.

۲٫۴ : حساسیت PCR
یک مجموعه رقت از map ایزوله ۰۲-۰۹۰۴، به صورت تصادفی، از محدوده ۱۰۶ به ۰٫۱ CFU در PCR به منظور برآورد حساسیت PCR انتخاب شد و مورد استفاده قرار گرفت. این مجموعه رقت با سیتومتری فاز جامد (ChemScan CHEMUNEX ، Ivry و سور سن فرانسه) تایید شد، که اجازه می دهد تا شمارش میکرو ارگانیسم ها سریعتر باشد . دستیابی به تعلیق تک سلولی map به علت دیواره سلولی بسیار آبگریز آنها دشوار است . به همین دلیل، حساسیت در کلنی ها بیان میشود که تشکیل واحد هارا به جای سلول های انفرادی بر عهده دارند در حالی که ۱ CFU می تواند شامل موجودات متعدد باشد. چندین کنترل منفی همیشه در PCR قرار دارد . یک روش دقیق برای جلوگیری از آلودگی متقاطع و یا به دنبال آن در بین نمونه ها یا حمل زیاد محصولات PCR انجام شد .
۲٫۵ : تجزیه و تحلیل سیلیکون در روش PCR
تجزیه و تحلیل کامپیوتری آزمایش PCR توسط میلار و واری و همکارانش برای آغازگرهای پ که به تازگی توسعه یافته در توالی مربوط به IS900 با استفاده از نرم افزار تقویت PCR انجام شد. آغازگرهای (p90/91) و /۹۲۱) ۱۵۰ ) توسط میلار و همکارانش شرح داده شده که هر دو به طور گسترده ای برای شناسایی و تشخیص مستقیم IS900 PCR map استفاده می شود. در گذشته، این آغازگرها نتایج مثبت کاذبی را ارائه میدهد وقتی که توالیIS900 اعمال میشود . درج توالی IS900 برای تجزیه و تحلیل سیلیکون انتخاب شدند . توالی های زیر استفاده شدند : : IS900، IS900 مانند، IS900 مانند WA-1 و WA-2 مانند IS900، IS1613، IS901 و IS902.

تقویت نرم افزار PCR اجازه شبیه سازی و تست واکنش های زنجیره ای پلی مراز را می دهد .این برنامه ورد استفاده قرار گرفت زیرا موجودات زنده ای که حاوی این عناصرند نمی تواند با استفاده از روش PCR مورد بررسی قرار گیرد . تقویت از دو مقیاس کیفیت مرتبط با پرایمر استفاده میکند . primability مقیاسی است که نشان میدهد چگونه پلیمراز DNA به راحتی قادر به گسترش توالی در ۳ انتهای پرایمر خواهد بود و پایداری مقیاسی است که چگونه پرایمر و هدف باهم مرتبطند.این دو مقیاس باید به بالاتراز نقطه توقف به منظور ارائه پرایمر مرتبط قرار گیرند .

۳: نتایج
۳٫۱ : ویژگی روش PCR
ویژگی روش PCR با استفاده از تجزیه و تحلیل DNA از پانل ۱۹۰ نمونه ای ایزوله های مایکوباکتریال (۷۴ نمونه map و ۱۱۶ نمونه غیر map) تایید شد. نتایج نشان می دهد که جفتهای پرایمر پاراتوبرکلوزیستنها mapDNA را تقویت میکند ولی جفت های غیر پاراتوبرکلوزیس را تقویت نمیکند . amplicons ها انتظار میروند که با توجه به توالی باند منتشر شده و نه ثانویه تشخیص داده میشوند . نتایج منفی با IS900 و روش f57 PCR برای DNA نسبت به map با ناکافی بودن روش PCR تناسب ندارد زیرا ، کنترل های مثبت همیشه بطورموثر تقویت میشوند .
۳٫۲ : حساسیت روش PCR
حساسیت برای هر دو جفت آغازگرهای پاراتوبرکلوزیستعیین شد. روش PCR IS900 میتواند ۱ CFU را در هر PCR تشخیص دهد. برای f57 روش PCR همچنین حد تشخیص ۱ CFU برای هر PCr بود.

۳٫۳ : تجزیه و تحلیل سیلیکون
خلاصه ای از نتایج تجزیه و تحلیل “در سیلیکون” با برنامه شبیه سازی تقویت PCR- در جدول ۴ داده شده است. آغازگرهای به تازگی توسعه یافته باید نتایج بسیار خوبی را در توالی IS900 (فقط باندهایی با اندازه مورد انتظار) دهد. انتظار می رود و آغازگرهای میلارو واری افزایشی را به بسیاری از گروههای ویژه ارائه دهند . برای IS900 مانند توالی (AF455253)، تکثیر ممکن است تحت شرایط بهینه PCR با آغازگرهای جدید به دست آید . برای WA-1 و WA-2 توالی IS900 مانند ، نباید هیچ آنیلینگی از آغازگرهای جدید به این توالی وجود داشته باشد در حالی که باید یک تقویت محصول را با آغازگرهای میلار و واری ارائه دهد . آغازگرهای میلار و آغازگرهای جدید نباید تقویتی را برای IS1613 و IS901 ارائه دهد. با آغازگرهای واری ، IS1613 تقویت خواهد شد. تمامی آغازگرها باید نتایج مورد انتظار را برای IS902 دهند .

۴ : گفتگو
تجزیه و تحلیل سیلیکون نشان می دهد که آغازگرهای واری و میلار باید افزایشی را به بسیاری از گروههای خاص و آغازگرهایی ارائه دهند که IS900 مانند توالی را تقویت میکند . این نتایج به وضوح نشان میدهد که این سنجش IS900 نمی تواند به عنوان یک ابزار تشخیصی مورد استفاده قرار گیرد . در این مطالعه، آغازگرهای جدید بر اساس دنباله ای از توالی های منحصر به فرد IS900 و f57 توسعه یابند . روش PCR در دنباله f57 به عنوان یک تست تکمیلی، برای تایید یا رد حضور IS900 PCR map پس از یک آزمون مثبت انتخاب شد. ویژگی روش جدید PCR برای هر دو جفت با DNA از ۱۹۰ نمونه مایکوباکتریال استخراج شده مورد بررسی قرار گرفت . تمامی ایزوله های map یک محصول PCR را با اندازه مورد انتظار ایجاد می کند . ایزوله های غیر از map ، از جمله M. avium ، هیچ تقویت مثبت کاذبی را تولید نکرد . نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که سنجش به تازگی توسعه یافته یک ابزار مفید برای شناسایی map میباشد . با این وجود سویه های حاوی IS900 مانند توالی را همانطور که توسط Englund و همکارانش و کازینز و همکارانش شرح داده شده تست نکردیم . با این حال ، شبیه سازی های کامپیوتری نشان می دهد که پرایمر های جدید نباید توالی های مانند IS900 را با شرایط مطلوب PCR تقویت کند . گرچه آغازگر های خاص IS900 در دست ما هستند ، ما همچنین روش f57 PCR را برای تایید وجود map پس از IS900 PCR مثبت پیشنهاد میکنیم . تجزیه و تحلیل سیلیکون با تقویت نشان داد که تقویت IS900 همانطور که توسط Englund و همکارانش توصیف شده با آغازگرهای جدید باید ممکن باشد درصورتی که شرایط PCR کمتر از حد مطلوب باشد . آخرین اطلاعات در مورد ویژگی IS900 نشان می دهد که استفاده از توالی دیگری به عنوان مشخصه پیشنهاد میشود . دنباله f57 دارای هیچ همسانی توالی با هر گونه شناخته شده نبوده و می تواند به عنوان جایگزین توالی مشخصه IS900 شناخته شود ، اما تحقیقات بیشتر در مورد این ژن ضروری میباشد . گام بعدی اعتبار سنجی با استفاده از روش PCR روی نمونه های بالینی میباشد همانگونه که گمان می کنیم حساسیت نمی تواند به اندازه ی محیط های باکتریایی که گزارش شده بالا باشد که این بخاطرحضور مهار کننده ها به واکنش PCR یا مشکل در استخراج DNA مایکوباکتریال میباشد . اولین آزمایشات در آزمایشگاه ما بر DNA استخراج شده از نمونه های مدفوع مشخص و بالینی نتایج امیدوار کننده ای ( ارتباطات شخصی ) را ارائه داد. در طول چند سال گذشته ، روش مبتنی بر Multiplex PCR برای شناسایی سویه های مایکوباکتریال متمایز در همان لوله PCR طراحی شده اند . روش دوپلکس PCR یک راه آسان ، سریع و ارزان را در شناسایی گونه های باکتریایی ارائه می دهد. ما فکر می کنیم که توسعه چنین PCR دوبلکس ( با هدف قرار دادن IS900 و f57 ) برای شناسایی map ممکن باشد . Bannantine و همکارانش در سال (۲۰۰۲) با مقایسه ژنوم مقیاس map و M. avium زیرگونه avium ، ۲۱ توالی انتخابی تشخیصی بالقوه را نشان دادند که می تواند دراستفاده از Multiplex PCR مورد استفاده قرار گیرد . با این حال ، هر یک از این توالی ها باید برای ویژگی خود با استفاده از یک پانل کامل مایکوباکتریوم SP DNA معتبرباشد .

۵ : نتیجه گیری
ترکیبی از دو روش PCR (روش IS900 PCR و روش f57) با آغازگرهای تازه توسعه یافته ثابت کرده اند که در شناسایی map برترند در اما اعتبارسنجی نمونه های بالینی باید انجام شود .

من سامان نصیری نویسنده این مقاله هستم.

تاریخ انتشار: 6 سپتامبر 2020
24 بازدید

مطالب مرتبط

دیدگاه ها

مجوزها و نمادها


logo-samandehi

پل های ارتباطی با ما …

تبریز ، بخش مقصودیه ، خیابان ارتش جنوبی، کوچه شهید شهابی ، بن بست باغچه ، پلاک ۸۷ ، طبقه 4
تلفن تماس : 04135421108-09307584802
ایمیل : entofa@gmail.com


Unit4,No87,Baghcheh Alley,South Artesh ST,Azadi ave,MAGHSUDIYEH, Tabriz, Iran
کلیه حقوق این وب سایت محفوظ می باشد . طراحی و توسعه آلسن وب    All rights reserved © 2020 Entofa