شماره تلفن : 09307584802

خانه ژورنال دانشجویان ایران

Iranian Students Article House

کشت بافت گیاه دارویی آلوئه ورا L

TISSUE CULTURE OF A MEDICINAL PLANT-ALOE VERA L

http://www.doc-developpement-durable.org

۲۰۰۷

Aloe vera syn barbadensis Mill. is an important medicinal plant and used world wide in drug and cosmetic industry. Although Aloe propagates vegetatively in its natural state, but propagation rate is too slow to meet demand of high quality planting material for commercial cultivation. Micropropagation method for elite selection of Aloe vera by axillary branching method using shoot tip as explant was standardized. Shoot cultures were initiated on MS medium containing BA 0.2mg/L with IBA 0.2mg/L. Maximum shoot proliferation was achieved on medium containing BA 1.0mg/L with IBA 0.2 mg/L within 28 days of culture. Shoot proliferation was better in liquid medium with same composition. Citric acid also enhanced shoot proliferation. A maximum of 5-multiplication rate of shoots was achieved with citric acid (10mg/L) in the medium. Hundred percent rooting of microshoots was obtained on phytohormone – free MS medium. Regenerated plants after hardening were transferred to soil and they showed 85% survival. The regenerated plants were morphologically similar to control plants

 

INTRODUCTION
Aloe vera syn barbadensis Mill. belongs to the family Liliaceae (Anonymous 1985). It is commonly called as ‘Burn plant’. It is a xerophyte and can be grown even in dry lands under rain fed conditions. Aloe is a coarse looking perennial plant with a short stem, found in the semi-wild state in many parts of the country (Figure 1). Leaves 30-60 cm long, erect, crowded in a basal rosette, full of juice, glaucous-green, narrow –lanceolate, long-acuminate, smooth except for the spiny teeth on the margins. Scape longer than leaves, scaly, branched. Flowers yellow, in dense racemes terminating the scapes. Commercial Aloes are obtained from wild as well as cultivated plants. Propagation is primarily by means of suckers (or) offshoots, which are separated carefully from mature plants and transplanted. Medium sized suckers are chosen and carefully dugout without damaging the parent plant at the base and can be directly planted in the field. Plants will produce a commercial crop in one year (Venkataramaiah 2003). Leaves exude a bitter liquid, which is dried and known as “bitter Aloes.” They also contain a clear gel, which is a soothing skin remedy. Leaves are broken off and the clear gel is applied to the skin as a first aid for burns. Aloe contains cathartic anthra-glycosides and its active principle ranging from 4.5 to 25% of Aloin. These are extensively used as active ingredients in laxative, anti-obesity preparation, as a moisturizer, emollient, wound healer, in various cosmetic and pharmaceutical formulations. It is a drug as well as a cosmetic. There are about more than 40 Aloe-based formulations being marketed in the global market. Aloin portion, which forms ‘Musambar’, is considered as drug and other two portions i.e., chips, gel is used in cosmetic industry. The clear gel contained in the leaf is a remarkably effective healer of wounds and burns, speeding up the rate of healing and reducing the risk of infection. The yellow sap from the base of the leaf when dried is known as “bitter Aloes” (Musambar). It is a strong laxative, useful for short-term constipation.

Key Constituents
Anthraquinones (aloin, Aloe – emodin), Resins, Tannins, Polysaccharides etc. The principal constituent of aloin is a water-soluble crystalline glycoside barbaloin [10(1)-deoxyglucosyl Aloe-emodin anthrone, C21H22O9.H2O, m.p.148- 1490C(anhyd.)].

Key Actions
It heals wounds, is emollient and stimulates secretions of bile. Aloe is laxative. Gels of different strengths, oil extracts, leaf concentrates, and powders are available. South African Aloe gives quality gel. The processed gel is used in different preparations such as1. Drugs 2. Cosmetics 3. Soft drinks 4.Food Preparations 5. Moisturizers 6. Healthcare products etc.

 

دانلود مقاله انگلیسی

کشت بافت گیاه دارویی آلوئه ورا L

 

چکیده
ترکیب آسیاب شده ی گیاه آلوئه ورا یک ترکیب گیاهی دارویی مهم است و در صنعت مواد دارویی و مواد آرایشی و بهداشتی کاربرد جهانی دارد . اگرچه گیاه آلوئه در حالت طبیعی خود از نظر گیاهی قلمه زده می شود ولی میزان قلمه زنی ها برای برآورد تقاضای کاشت موادی با کیفیت بالا برای کشت تجاری ، بسیار پایین است . روش افزایش تدریجی برای انتخاب آلوئه ورا توسط روش گوشه شاخه ای با استفاده از نوک جوانه ها بعنوان ریز نمونه استاندارد شده بود . کشت جوانه ها در محیط کشت حاوی ۰٫۲ میلی گرم BA همراه با ۰٫۲ میلی گرم lBA آغاز شدند. حداکثر افزایش جوانه ها در طیّ ۲۸ روز کشت، در محیط کشتی حاوی ۱٫۰ میلیگرم BA همراه با ۲٫۰ میلیگرم lBA بدست آمد . افزایش جوانه در محیط کشت مایع با ترکیب مشابه بهتر بود . اسید سیتریک نیز با افزایش جوانه افزایش یافت . حداکثر میزان ۵ افزایش تدریجی جوانه ها با اسید سیتریک ( ۱۰ mg/L ) در محیط کشت بدست آمد . صد در صد ریشه زایی ریز جوانه ها بر روی هورمون رشد بافتی گیاه ایجاد شد – که خارج از محیط کشت بود . گیاهان بازسازی شده بعد از عمل سفت شدگی به خاک منتقل شدند و آنها بقاء ۸۵% را نشان دادند . گیاهان بازسازی شده از نظر ساختاری شبیه به گیاهان کنترل شده هستند .

 

مقدمه
گیاه آلوئه ورا متعلق به گروه گلهای یاس است ( نام برگرفته شده – ۱۹۸۵ ) . که بطور معمول به آن ” گیاه سوختگی ” می گویند . آن نوعی گیاه خشک زی است و حتی در مناطق خشکی که تحت شرایط بارندگی جزئی هستند هم رشد می کند . گیاه آلوئه ورا ، گیاهی چند ساله و زبر با ساقه ی کوتاه است که در بسیاری از نقاط کشور بصورت نیمه جنگلی یافت می شود . ( شکل ۱ ) . و دارای این ویژگی ها است : برگهایی به طول ۶۰ – ۳۰ سانتی متر ، پر از گلبرگ های پایه ای قائم ، سرشار از عصاره ، رنگ سبز مایل به زرد ، حالتی نوک تیز ، دارای سطحی صاف جز اینکه دارای دندانه های خارداری در لبه های آن وجود دارد . ساقه ها بلندتر از برگ ها ، فلس مانند و شاخه ای هستند . گلها زرد رنگ هستند ، و بصورت خوشه های انبوه ، ساقه ها را می پوشانند . آلوئه های تجاری از گیاهان وحشی و همچنین گیاهان کشت شده بدست آمده اند . عمل انتشار اصولا بوسیله مکنده ها و یا جوانه ها می باشد که با دقت از گیاهان رشد یافته جدا می شوند و پیوند زده می شوند . مکنده های متوسط انتخاب می شوند و بدون تخریب گیاه منشأ در انتهای آن ، حفر می شوند و مستقیما در زمین کاشته می شوند . گیاهان در یک سال ، یک محصول تجاری را تولید خواهند کرد ( ون کاتارامایاه ، ۲۰۰۳ ) . برگ ها مایع تلخی را تراوش می کنند که خشک می شود و بعنوان ” آلوئه های تلخ ” شناخته میشوند . همچنین آنها دارای ماده چسبنده ی شفافی هستند که داروی آرامش بخش پوستی هستند . برگ ها قطع می شوند ( شکسته می شوند ) و ماده پسبنده ی شفاف بعنوان اولین درمان برای اثر سوختگی پوست بکار میرود . گیاه الوئه دارای آنترا گلیکوزید مسهل است و اصل موثر آن از ۴٫۵ % تا ۲۵% ماده آلویین می باشد . اینها بطور گسترده بعنوان عناصر فعال در ضدّ یبوست ، ضدّ چاقی بعنوان یک لوسیون ، نرم کننده ( ملیّن ) ، التیام دهنده زخم در فرمولاسیون دارویی و آرایشی و بهداشتی بکار میروند . این گیاه دارویی است که کاربرد آرایشی و بهداشتی هم دارد . حدود بیش از ۴۰ ترکیب اصلی آلوئه در بازار جهانی فروخته میشود . قسمتی از آلویین که ماده “موسامبار ” را ایجاد می کند ، بعنوان یک دارو در نظر گرفته میشود و دو قسمت دیگر یعنی ورقه ها ، ماده چسبنده در صنعت لوازم آرایشی و بهداشتی کاربرد دارند . ماده چسبنده ی شفاف که در برگ موجود است ، التیام دهنده ی موثر زخم ها و سوختگی ها است ، میزان التیام را سریعتر می کند و خطر عفونت را می کاهد . شیره زرد رنگی در انتهای برگ وجود دارد که وقتی خشک میشود با نام ” آلوئه تلخ ” شناخته می شود ( موسامبار ) . این شیره ملیّن قوی است و برای یبوست کوتاه مدت مفید است .

( شکل ۱ : بهترین ماده گیاهی الوئه ورا ، در حال رشد و پرورش در طرح آزمایشی . )

اجزا اصلی تشکیل دهنده :
آنتراکوینین ( آلویین ، آلوئه ، ایمودین ) ،رزین( صمغ کاج) ، تانن ( جوهر مازو ) ، پلی ساکارید ها و غیره . جزء اصلی آلویین ، یک محلول شفاف گلیکوزید در آب است . { (۱) ۱۰ دئوکسی گلوکوزیل آلوئه – ایمودین ، C_21 H_22 O_(9.) H_2 O ، ۱۴۸ – ۱۴۹ درجه سانتی گراد ( anhyd ) } .

تأثیرات اصلی :
این گیاه که زخم ها را التیام می بخشد ، ملّین است و ترشحات صفرا را تحریک می کند . آلوئه ملیّن است . ژل با مقاومت های متفاوت ، شیره روغن ، ترکیبات برگ ، و پودر ها موجود هستند . آلوئه ی آفریقای جنوبی ژل با کیفیتی را ارائه می دهد . ژل تهیه شده در آماده سازی های متفاوتی مانند ۱ ) داروها ۲ ) لوازم آرایشی ۳ ) نوشیدنی های غیر الکلی ۴ ) تهیه موّاد غذایی ۵ ) لوسیون ها ۶ ) محصولات بهداشتی و غیره کاربرد دارد .
کاربردهای سنتی و امروزه :
درمان زیبایی : آلوئه ورا بعنوان لوسیون پوستی تاریخچه ی وسیعی دارد . بیان شده است که ملکه مشهور مصر ، کلئوپاترا ، زیبایی خود را از این گیاه می داند .
داروی غربی : در غرب ، آلوئه ورا برای نخستین بار در دهه ۱۹۵۰ مشهور شد ، وقتی که قابلیت آن برای التیام سوختگی ، مخصوصا سوختگی ناشی از تشعشع گرما کشف شد .
نخستین داروی کمکی : آلوئه ورا نخستین داروی کمکی عالی برای نگهداری در خانه برای سوختگیی ها ، اثر خراشیدگی ، تاول ، و آفتاب سوختگی است . از یک برگ جدا شده ، ماده ی چسبنده ی آرام بخشی بدست می آید که برای قسمت آسیب دیده بکار میرود .
خنک سازی پوست : این ژل برای هرگونه شرایط پوستی که نیاز به آرام بخشی دارد ، مفید است و تا اندازه ممکنبرای بهبود سیاهرگ های واریسی موثر است .
زخم معده : همچنین اثر التیامی و حفاظتی آلوئه ورا بطور درونی هم عمل می کند و ماده چسبنده می تواند برای زخم های گوارشی و علائم تحریک پذیر شکمی بکار رود .
ملیّن : مایع تلخ زرد رنگ در برگ ها ( آلوئه های تلخ ) دارای آنتراکوئنین می باشد که بطور موثری ملیّن هستند . آنها موجب می شوند تا روده یزرگ منقبض شود ؛ بطور کلی ۱۲ – ۸ ساعت بعد از مصرف دارو ، تحریکات شکمی را ایجاد می کند . در مقادیر کم ، خواصّ تلخ گیاه موجب تحریک عمل گوارش می شود . در مقادیر بیشتر ، آلوئه های تلخ ملیّن و مسهل هستند .
سوختگی های جزئی و آفتاب سوختگی : ژل آلوئه ورا را به مقدار مورد نیاز در موضع مورد نظر بمالید .
خطوط ایجاد شده بر روی پوست بر اثر کاهش وزن : ژل آلوئه ورا را بر روی موضع مورد نظر بمالید .
زگیل ها : ژل را مستقیماً بر روی موضع ۳- ۲ مرتبه در روز بمالید و این کار را تا ۳ ماه ادامه دهید .
زخم ها : زخم را با ژل تمیز کرده و با یک پارچه آغشته به ژل بپوشانید .

حدود ۲۲ اسید آمینه برای بدن انسان لازم است که از این مقدار ، ۸ اسید آمینه ی مهم در آلوئه ورا یافت می شود . ویتامین های A , B1 ,B2,B6,B12,C,و E که بدن انسان نمی تواند تولید کند ، در گیاه آلوئه ورا موجود است . مصرف روزانه ی ژل بدون آلویین آلوئه ورا – یک شیره زرد رنگ ، برای سلامتی مناسب است و ایمنی طبیعی را بهبود می بخشد . مطالعات پژوهشی انجام شده بر روی گیاه الوئه ورا نشان داده اند که از طریق تقویت سلولهای خونی لمفوسیت T ، آن قادر به التیام زخم ها و بهبود ایمنی می شود ( لی و کیم ، ۲۰۰۰ ) .
آب تازه ی برگ مخلوط شده با پودر زردچوبه ، بهترین کاربرد بیرونی برای زخم ها ، سوختگی ها و غیره است . افراد قبیله ای و روستایی که به بزغاله ها و گاوها در مناطق جنگلی غذا می دهند ، معمولاً آب گیاه آلوئه ورا را بطور بیرونی برای پوست سر در تابستان بکار می برند تا بدن را از اثرات تشعشعی و آفتاب زدگی محافظت کند . این گیاه یک ضدّ اکسنده ی تثبیت شده ، ایمن و مطلوب است که برای چلوگیری از فرآیند پیرشدگی مفید است و بطور ایمن قابل استفاده برای گروه کودکان تا گروه سالمندان صرفنظر از نوع جنسیت و تفاوت سنّی می باشد . ژل آلوئه ورا اثر ایمنی بسیار قدرتمندی را می بخشد که در بیماران دارای ایدز ، سل ریوی ، و سرطان برای غلبه بر علائم ، کاربرد دارد و طول عمر زندگی آنها را افزایش می دهد . این ژل التیام دهنده طبیعی و مادّه آرایشی – بهداشتی ایمن برای همه گروه های سنّی مردان و زنان می باشد . این ژل پوست را محافظت می کند و رنگ چهره را بهبود می بخشد . این گیاه یک لوسیون طبیعی است .
فناوری کشت بافت و عضو در تکثیر سریع گیاهان ، پیشرفت محصولات ژنتیکی ، بدست آوردن ابزار همگن بدون بیماری و حفظ گونه های ارزشمند بکار می رود ( بوجوآنی و رازدان ، ۱۹۹۲ ) . یکی از کاربرد های اصلی کشت بافت گیاه ، افزایش تدریجی و یا تکثیر سریع است . در مقایسه با افزایش متداول ، افزایش تدریجی این مزیّت را دارد که تکثیر سریع را در محدوده زمانی و مکانی میّسر می سازد .
اگرچه گیاه آلوئه از نظر گیاهی در حالت طبیعی خود ، تکثیر و منتشر میشود ، اما سرعت افزایش محصولات گیاهی تجاری بسیار آرام است ( میر و استادن ۱۹۹۱ ) .
با غلبه بر میزان آرام تکثیر ، افزایش تدریجی ، فناوری بسیار موثری در تکثیر انبوه گیاه آلوئه خواهد داشت . از اینرو ، با تمام این دیدگاه ها و بررسی ها ، این پروژه برای استانداردسازی شرایط مورد لزوم کشت گیاه آلوئه ورا توسط فناوری های کشت بافت انجام شده است .
هدف مطالعاتی موجود در موارد زیر :
استاندارد سازی شرایط بهینه برای
ایجاد کشت جوانه ی غیر الوده از گونه ای عالی .
تکثیر ریز جوانه ها .
ریشه دار کردن ریز جوانه ها .
عمل سفت شدگی و انتقال گیاهان به خاک .

” بررسی مقدماتی ”
کشت بافت گیاه ، استقامت بیوتکنولوژی گیاهی را ایجاد می کند ، یعنی افزایش تدریجی ، القاء ترکیب ژنتیکی گیاهان ، پیوند زنی گیاهی ، انجماد و تولید مجدّد گیاهان نرانس ژنتیک . کشت بافت گیاه ، جزء اصلی بیوتکنولوژی گیاهی است . سلول گیاهی و کشت بافت همواره کمک قابل توجهی به بهبود محصول می کند و پتانسیل زیادی برای آینده دارد . ( کوملر و کومار ۱۹۹۶ ) . اقدامات پژوهشی در مورد سلول گیاهی و کشت بافت در سالهای اخیر بطور چشمگیری در سراسر جهان افزایش یافته است مانند اقداماتی در کشورهای در حال توسعه . سلول گیاهی و کشت بافت بعنوان توانایی برای تولید مجدّد و تکثیر گیاهان از تک سلول ها ، قرار گرفتن بافت ها و اجزاء تحت شرایط محیطی کنترل شده و سترون تعریف می شوند . ( موراشینگ و اسکوگ ۱۹۷۴ ) . در کشور هند ، پژوهش کشت بافت حدود چهار دهه قبل با نخستین گزارش تولید پیوند لوله آزمایشی شروع شد ( کانتا و همکارانش ۱۹۶۲ ) . فناوریهای کشت بافت اکنون بطور گسترده ای برای بهبود محصول مزرعه ، جنگل و محصول باغبانی و کشت و زرع برای افزایش تولید کشاورزی و جنگلداری بکار میرود . امروزه تکنولوژی کشت بافت بطور عمده برای افزایش تولید و یا افزایش تدریجی مواد کاشت عالی با ویژگی های مطلوب مورد بهره برداری قرار می گیرند . این تکنولوژی در سراسر جهان بطور تجاری انجام می شود و به میزان قابل توجهی به افزایش تولید مواد کاشت با کیفیت بالا کمک می کند . اخیراً تأکید بر روی انتقال ژن بوده است مخصوصاً برای ۱ ) افزایش تولید متابولیت های ثانویه . ۲) تولید آلکالوئیدها ، داروها ، ترکیبات نابودی آفات و همچنین یافت نشدن برخی از ترکیبات جدید در سراسر گیاه ، تولید مجدّد مقاومت گیاه به علف کش ها ، بیماری ها و آفات . ۳ ) افزایش مقیاس کشت در بیورآکتورها ۴ ) گیاهانی با ویژگی های ساختاری متفاوت و ۵ ) گیاهان ترانس ژنیک برای تولید واکسن و غیره . این پیشرفت ها به همان اندازه هم در بهبود گیاهان دارویی ، الزامات دور از دسترسی هستند . ( باجاج ۱۹۹۸ ).
افزایش تدریجی برای سرعت انتشار اولیه گونه های جدید قبل از عمل تکثیر توسط روش های مرسوم مثل روش آناناس ( درو ۱۹۸۰ ) ، روش توت فرنگی ( اسمیت و درو ۱۹۹۰ ) مفید بوده است . همچنین افزایش تدریجی برای پیشرفت ذخیره سازی گونه ها برای حفظ ته ساقه ی بدون عیب در شرایط کنترل شده ی محیطی ( ویترز ۱۹۸۰ ) و شرایط بلند مدت از طریق انجماد ( کارتا و گروهش ۱۹۸۰ ) بکار میرود . تکثیر رویشی در شرایط آزمایشگاهی مزایای مهمی برای تولید خطوط پایدار در گیاهانی که هیچ گونه ی مشخصی ندارند ، دارد مانند گونه ی آنونا ( بریج ۱۹۹۳ ) ، نماد ژنی دو پایه درخت پاپااو ( درخت نخل آمریکای جنوبی ) ( درو ۱۹۸۸ ، درو ۱۹۹۲ ) که اصلاح گیاهان سنتی با عدم موفقیت همراه بوده است . همچنین آن پتانسیل عظیمی برای تکثیر محصولات مهم مانند گونه ی نشاسته کاساو ، گونه فاسلوس ، گونه سولانوم ( گیاه تاجریزی ) دارد ( روکا و موگینسکی ۱۹۹۱ ) . افزایش تدریجی گیاهان انتخاب شده و عالی نتایج خوبی را نشان می دهد که در امر کشاورزی ، باغبانی و جنگلداری مفید می باشد . ( کانگر ۱۹۸۱ ، درو ۱۹۹۷ ) . در سراسر جهان اشتیاق زیادی برای ترویج و توسعه تکنولوژی آزمایشگاهی وجود دارد که منجر به انتشار و پرورش لوازم چوبی تجاری با ارزش ، نیمه چوبی ، گیاه زینتی ، غذای اصلی و گیاهان دارویی و صنعتی میشود . که این گونه ها که در معرض خطر انقراض هستند باید برحسب حفاظت گونه ها اولویت بندی شوند ( کانگر ۱۹۸۱ ، دیبرگ و زیمرمان ۱۹۹۰ ، درو ۱۹۹۷) .
گیاه آلوئه ورا توسط پژوهشگران مختلفی در شرایط آزمایشگاهی کشت شده است ، پژوهشگرانی مانند : گروه سانچز ( ۱۹۸۸ ) ، گروه ناتالی ( ۱۹۹۰ ) ، میر و استادن ( ۱۹۹۱ ) ، روی و سارکار ( ۱۹۹۱ ) ، گروه کورنیو ( ۱۹۹۴ ) ، گروه ریچواین ( ۱۹۹۵ ) ، آبری و استادن
( ۲۰۰۱ ) ، چادهوری و موکاندان ( ۲۰۰۱ ) .
گروه سانچز( ۱۹۸۸ ) افزایش تدریجی را از سلول نارس ساقه انجام دادند . آنها متوجه شدند که کشت آزمایشگاهی گیاه آلوئه برای القاء کالوس ( پینه استخوانی گیاه ) و همچنین برای تولید مجدّد گیاه بسیار مشکل است . یک مطالعه غلظت سنج DNA بر روی اعضاء متفاوت گیاه آلوئه و در مدت کشت آزمایشگاهی ریزنمونه های مختلف انجام شد .
گروه ناتالی ( ۱۹۹۰ ) تأثیر سریع و موثر افزایش تدریجی گیاه از بافت های نارس ساقه را گزارش دادند . عمل افزایش تدریجی توسط کشت گونه های رویشی ساقه در محیط کشت دارای ۲,۴ D و Kn در مدت ۳۰ – ۱۵ روز بدست آمد . توانایی تشکیل ساختار توسط انتقال ریزنمونه ها در محیط کشت دارای ۲,۴ D و بنزیلامینوپورین – ۶ نگهداری می شود . ( ناتالی ۱۹۹۰ ) .
گیاهان آلوئه در شرایط آزمایشگاهی در محیط کشت رشد دارای ۲,۴ D و سیتوکین ها کشت شدند ( گروه گروئن والد ۱۹۷۵ ، گروه ناتالی ۱۹۹۰ ) . توسعه گوشه ای جوانه و تشکیل نابجای جوانه با ریزنمونه های ساقه جدا شده ی آلوئه بدست می آید . حداکثر رشد جوانه و ریشه زایی ساقه ها در محیط کشت بهبود یافته ی ” موراشیگ ” و ” اسکوگ ” که با IBA تکمیل میشود ، بدست می آید . دمای مطلوب برای رشد و توسعه جوانه ۲۵℃ بود . رشد جوانه در دمای ۱۰℃ نشان داده شد . ( میر و استادن ۱۹۹۱ ) .
همچنین گیاه آلوئه بعلت ارزش بالای دارویی و زیستی آن کشت میشود ( گروه ویج ۱۹۸۰ ) . اقدام جزئی بر روی کشت کالوس گونه های گیاه آلوئه انجام شده است ، چون ایجاد کشت های اولیه بعلت تراوش فنولیکی توسط ریزنمونه مشکل است . فقط یک گزارش در مورد تشکیل کالوس ( پینه استخوانی گیاه ) و تولید مجدّد گیاه از سلول گیاهی دانه ی گیاه آلوئه وجود دارد ( گروه گروئن والر ۱۹۷۵ ) . روی و سارکار ( ۱۹۹۱ ) انتشار سریع توسط تشکیل ساقه ها از سلول گیاهی به آلوئه ورا را گزارش دادند . آنها موجب تحریک تشکیل کالوس در بخش های ریشه ای از ساقه های گوشه ای جوان می شوند که در ساقه های ریشه مانند زیرزمینی رشد می یابند . پلی وینیل پرولیدون ( نوعی ماده شیمیایی در تولید مواد دارویی و غیره ) برای کاهش تراوش مواد فنولیکی از ریزنمونه بکار میرود . محیط کشت بهبود یافته دارای ۲,۴ D و کینتین برای القاء کالوس بکار می رفت . ( روی و سارکار ۱۹۹۱ ).
افزایش تدریجی گیاه آلوئه توسط اجزاء کشت از ساقه های گوشه ای محیط کشت بدون تنظیم کننده های رشد انجام می شود (که بعنوان جلوگیری از مرحله اول توسعه و پیشرفت می باشد . ) برای مرحله دوم توسعه شامل نهال های تازه شکل گرفته ، وجود یک سیال مغناطیسی در محیط کشت موجب تحریک تولید ساقه ثانویه ، توسعه کلی و ریشه ای گیاه میشود . ( گروه کورنینو ۱۹۹۴ ).
گروه ریچواین ( ۱۹۹۵ ) القاء محیط کشت گونه های آلوئه ، گاستریا و هاورتیا از شکوفایی نارس را گزارش دادند .ساقه ها در یک محیط کشت بهبود یافته دارای زیتین ( هورمون گیاهی ) آغاز می شوند و سپس در محیط کشت دارای زیتین و BA نگهداری میشوند .
نوعی قاعده سریع انتشار برای گیاه پلی فیلا A که به شدت در معرض خطر بود ، ایجاد شد . دانه در محیط کشت در شرایط آزمایشگاهی دارای ساکاروز و بدون ساکاروز ( شکر چغندر قند ) رشد کرد . بوته ها در محیط کشت دارای بنزیل آدنین ( BA ) و یا ترکیبی از BA و NAA مورد کشت قرار گرفتند . بعد از مشکلات اولیه همراه با به رنگ قهوه ای در آمدن ، ریزنمونه ها به سرعت جوانه های نابجا و گوشه ای را شکل دادند . ( آبری و استادن ۲۰۰۱ ) .
چادهوری و موکاندان ( ۲۰۰۱ ) ، هم گزارش دادند که در ساختار ساقه های چندگانه گیاه آلوئه ورا در شرایط آزمایشگاهی ، تابع سیتوکین و غلظت اکسین هم وجود داشت . وجود سیتوکین و یا اکسین منجر به تشکیل ریشه و یا کالوس میشود . بهترین تکثیر ساقه ها در محیط کشت دارای BA + نوعی بازپورین سولفات + IAA بدست آمد .

” مواد و روش ها ”
گیاهان عالی ، سالم و بدون علائم بیماری ، مشکلات آفات هستند و محصول زیست – توده ی مناسبی را نشان دادند. ما رشد گیاه را در طرح آزمایشی مرکز تیفاک جمع آوری کردیم . ساقه با برگ های نورسته ی گیاهان عالی جمع آوری میشوند . برگ های اضافی از بین رفتند و ساقه تا اندازه ۳ – ۲ سانتی متر برای کار بعدی کوتاه شدند .
سترون سازی ریز نمونه :
برای سترون سازی سطح ، در وهله نخست ریزنمونه ها بطور کامل در آب شیر جاری به مدت ۳۰ دقیقه ، شتشو داده شدند . بعد از آن ، آنها دوباره با مایع شوینده ( رانکلین ، رانباکسی ، هند ) و تویین ۲۰ ( آزمایشگاه های هیمدیا ، هند ) به مدت ۱۰ دقیقه با تکان شدید شسته شدند. بعد از شستن با موادّ شوینده ، ریزنمونه ها دوباره به مدت ۳۰ دقیقه با آب شیر جاری شسته شدند تا هرگونه اثری از موادّ شوینده از بین برود و در محلول باویستین %۱ w/v به مدت یک ساعت نگهداری شدند ( BASF هند ) . سپس ریزنمونه ها به محلول ساولون %۱ v/v به مدت ۲ -۱ دقیقه تغییر یافتند ( جانسون و جانسون ، آمریکا ) . بعد از این آزمایش ها ، ریز نمونه ها داخل پوششی که دارای ورقه نازکی بود ، برای سترون سازی بعدی قرار گرفتند . در اینجا ۳ – ۲ ماده شستشوی سترون آبی ارائه شدند . بعد از این شستشو ها ، ریز نمونه ها بیرون آورده شدند و به مدت ۳۰ ثانیه آغشته به الکل اتیل ۷۰% شدند . بعد از آغشته شدن به الکل ، ریز نمونه ها دارای سطوح استریل شده به مدت ۵ دقیقه با محلول آبداری از کلرید جیوه %۰٫۱ w/v آماده شدند . بعد از روش کلرید جیوه ، ریز نمونه ها به مدت ۴ – ۳ دقیقه با آب مقطر بطور کامل شستشو داده شدند تا هرگونه اثری از کلرید جیوه از بین رفت .

محیط های کشت :
محیط کشت اصولی مورد کاربرد برای کشت ، محیط کشت موراشیگ و اسکوگ ( MS , 1962 ) با ۳% ساکاروز ( درجه آزمایشگاهی ، هیمدیا ، هند ) و هورمون های رشد می باشد .

 

ترکیب محیط کشت اصولی موراشیگ و اسکوگ ( MS ) :
نمک درشت ( میلیگرم در هر لیتر )
KNO_3( پتاسیم نیترات ) ۱۹۰۰
) NH_4 NO_3 آمونیوم نیترات ) ۱۶۵۰
MgSO4.7H2O( منیزیم سولفات ) ۳۷۰
CaCl2.2H2O ( دی هیدرات کلسیم کلرید ) ۴۴۰
KH2PO4(مونوپتاسیمفسفات ۱۷۰

نمک های ریز
MnSO4.H2O ( مونوهیدرات منگنزسوافات ) ۲۲٫۳
ZnSO4.7H2O ( مونوهیدرات زینک سولفات ) ۸٫۶
H3BO3 ( اسید بوریک ) ۶٫۲
KI ( کلونوپین ) ۰٫۸۳
Na2MoO4.2H2O ( دی هیدرات سدیم مولیب دیت ) ۰٫۲۵
CuSO4.5H2O ( پنتاهیدرات کلسیم فسفات ) ۰٫۰۲۵
CoCl2.6H20 ( هگزاهیدرات کلرید کبالت ) ۰٫۰۲۵
Na2Fe-EDTA ( سدیم آهن ) ۳۷٫۲۴

موادّ افزودنی میلیگرم در هر لیتر
هیدروکلریک تیامین ۰٫۱
اسید نیکوتین ۰٫۵
هیدروژن کلرید الکل فنولیک ۰٫۵
گلیسین ( نوعی اسید آمینه ) ۲٫۰
میواینوزیتول ۱۰۰
ساکاروز ۳۰۰۰۰

بنزیلامینوپورین – ۶ ( BA ) ، اسید ایندولبوتیریک (IBA ) ، کینتین ( Kn ) ، آدنین سولفات به محیط کشت اصولی بصورت تنها و با ترکیبات متفاوت افزوده شدند .
محلول های غلیظ ساقه ای از همه ی مواد تشکیل دهنده آماده شدند و در سرد خانه نگهداری شدند . برای آماده سازی محلول ساقه ای از نمک ریز ها ، همه نمک ریز ها در مقادیر مورد نیاز در یک لیتر آب مقطر حل شدند و بعنوان محلول ساقه ای بکار رفتند . همچنین محلول های ساقه ای دیگر موادّ تشکیل دهنده ، آماده شدند و در سردخانه نگهداری شدند . و مشابهاً محلول های ساقه ای هورمون های رشد نیز تهیه شدند . سیتوکین ها در چند قطره از محلول های اسیدی ( ۱N HCI ) حل شدند و اکسین ها در چند قطره از محلول های اصلی ( ۱N KOH ) حل شدند ، بعد از حل شدن ، حجم نهایی با کمک آب مقطر ایجاد می شود و در دمای ۴℃ نگهداری شدند . ( تنظیم کننده های رشد از نوع سیگما هستند ، آمریکا ) .
محیط کشت با افزودن مقدار مورد نیاز از همه موادّ تشکیل دهنده در تنگ آزمایشگاهی مخروطی تهیه شدند . بعد از افزودن همه موادّ تشکیل دهنده به مقدار لازم ، حجم نهایی با کمک آ مقطر ایجاد شد . میزان اسیدی / بازی بودن ( pH ) محیط کشت ، توسط ۱N KOH و یا ۱N HCI به ۵٫۸ تنظیم شد . ( سایبراسکن ۵۱۰ ، ابزار اوتچ ، سنگاپور ) . بعد از تنظیم میزان اسیدی / بازی ، آگار ( هیمدیا لابس ، هند ) در میزان ۰٫۸ w/v بمنظور انجماد محیط کشت افزوده شد . برای آماده سازی محیط کشت مایع ( در هر کجا که لازم باشد )، آگار به محیط کشت افزوده نشد . بعد از ریختن مواد ( ۵۰ – ml /300ml بطری ) ، بطری ها بطور سفت و محکم پوشش دار و بطور دقیق برچسب گذاری شدند . بعد از آن ، مواد در دمای ۱۲۱℃ به مدت ۲۰ دقیقه در ۱۵psi اتوکلاو شدند . ( اکویترون ، ابزار پزشکی ، هند ) .

تلقیح ریز نمونه ها :
بعد از سترون سازی ریز نمونه ها ، ریز نمونه ها در بطری های ضدّ عفونی شده کشت تلقیحی شدند . برای تلقیح ، ریز نمونه ها به پتری پلیت ( ظرف کوچک مخصوص کشت میکروب ) شیشه ای بزرگ استریل شده و یا ظرف شیشه ای منتقل شدند که این حالت با کمک پنس استریل تحت شرایط دقیق ضدّ عفونی بود . سپس ریزنمونه ها جدا میشوند و برگ های اضافی بیرونی بمنظور ایجاد آنها در اندازه های مناسب از بین رفتند . برگها با تیغه برش استریل برداشته شدند . بعد از برش ریزنمونه ها در اندازه مطلوب ( ۳ – ۲ سانتی متر ) ، ریز نمونه ها به بطری های کشت حاوی محیط کشت MS ( موراشیگ و اسکوگ ) با ۰٫۲ میلیگرم در لیتر BA و ۰٫۲ میلیگرم در لیتر IBA منتقل شدند . بعد از تلقیح عمودی ریز نمونه ها در بطری کشت ، دهانه بطری به سرعت مشتعل شد و بطری ها بطور محکم پوشانده شدند و دهانه بطری ها بطور دقیقی با غشاء کلین بسته شدند که این حالت به منظور جلوگیری از ورود هوای اضافی بود . بعد از اینکه برچسب گذاری دقیق ، بطور وضوح کد مواد ، زمان تلقیح و غیره را بیان کرد ، بطری ها به اتاق رشد منتقل شدند .

تکثیر ساقه :
برای تکثیر ساقه ، ( ۰ -۱ mg / L ) BA و ( ۰ – ۱ mg / L ) Kn در غلظت های مختلف در ترکیب با ( ۰٫۲ mg / L ) IBA ، اسید سیتریک (۰, ۱۰, ۱۰۰ mg/L) ، آدنین سولفات (۱۶۰ mg/L) و آگار (۰, ۰٫۸%) مورد استفاده قرار گرفتند . بعد از ۲۸ روز از دوره کشت ریز نمونه ها با شکلی جدید ، ساقه ها تحت شرایط ضدّ عفونی دقیق ، پاک شدند و با کمک تیغه برشی استریل و پنس استریل از گیاه اصلی جدا شدند و در بطری های جدیدی حاوی محیط کشت اصولی MS با مجموعه ای متفاوت از هورمون های رشد ، تلقیح شدند همانطور که قبلاً بیان شد . دو ساقه در هر بطری کشت استفاده شدند و همچنین ۶- ۴ تکرار در هر آزمایش بکار رفت . بعد از ۲۸ روز کشت ، داده ها ثیت شدند و فقط ساقه های بزرگتر از ۲ سانتی متر برای بررسی اطلاعات در نظر گرفته شدند . هرگونه مراقبت ممکنه برای جلوگیری از هرگونه آلودگی بعدی لحاظ شد .

ریشه زایی ریز ساقه ها :
ساقه ای تازه شکل گرفته به طول ۴ – ۳ سانتی متر ، بطور جداگانه از ریزنمونه اصلی برداشته شدند و به محیط کشت ریشه زایی منتقل شدند . سه نوع از محیط های کشت ریشه زایی بکار رفتند ، یک محیط کشت اصولی MS بدون هورمون ، و محیط کشت اصولی دیگر دارای هورمون
(IBA 1mg/L) . همچنین در اینجا ما هم از محیط های کشت جامد و هم مایع استفاده می کنیم . سه – پنجم ساقه ها در هر بطری کشت مورد کاربرد بودند و ۵ مرتبه تکرار در هر آزمایش انجام شد . داده ها بعد از گذشت ۱۵ روز از کشت ثبت شدند .

شرایط کشت :
همه کشت ها تا زیر ۱۶ ساعت دوره نوری با شدت نوری ۲۵۰۰ – ۲۰۰۰ لاکس ، کشت میکروبی شدند . ( ارائه شده توسط پلی لاکس XL ، بریتانیا GE ، ۳۶ وات و دمای ۲۵± ۱۰C)

سازش با محیط : ( نوعی فرآیند فیزیولوژیکی ) :
بعد از گذشت ۱۵ روز از کشت در محیط کشت ریشه زایی ، گیاهچه ها برای مرحله سفت شدگی قبل از انتقال نهایی به خاک در شرایط طبیعی ، به گلدان های پلاستیکی منتقل شدند . برای سفت شدگی گیاهان ، گیاهانی با ریشه های تازه شکل گرفته ، از بطری های کشت با کمک پنس با دقت زیاد بیرون آورده شدند که این کار بعلت جلوگیری از هرگونه آسیب به ریشه های تازه شکل گرفته بود و سپس در آب گرم و نه داغ آغشته شدند تا هرگونه اثری از پوشش آگار سفت شده از بین رفت . بعد از حذف مرحله کشت ، برای جلوگیری از هرگونه عفونت قارچی در مورد گیاهانی که به تازگی رشد کرده اند ، آنها را در محلول ۱% w/v باویستین آغشته کردند . بعد از روش باویستین ، گیاهچه ها با دقت در گلدان های پلاستیکی دارای ترکیبی از خاک و کود دامی به میزان ۱:۱ کاشته شدند . بعد از کاشت ،گیاهان بطور کامل آب دهی شدند و تحت شرایط گلخانه ای دارای ۸۰% رطوبت و دمای ۳۱℃ و به مدت ده روز نگهداری شدند . در مدت این ده روز ، گیاهان بطور کامل بوسیله آب پاش برای حفظ سطح رطوبت مورد نیاز آب دهی شدند . در مدت این ده روز ، گیاهان به سایه خانه دارای سطح رطوبت کمتر و نور خورشید غیر مستقیم منتقل شدند . در سایه خانه هم گیاهان دو مرتبه در روز یعنی صبح و عصر برای جلوگیری از پژمردگی ( در صورت لزوم ) آب دهی شدند .

جداسازی DNA :
برای جداسازی DNA ، ما از بسته استنتاجی DNA گیاه CTAB ( ستیل ترمتیلامونیوم برومید ) ، ارائه شده توسط سازمان جنئی ، بانگالور ، استفاده می کنیم . ترکیب و محلول های مورد کاربرد در بسته ، به شرح زیر و طبق دستور العمل های تولید کننده هستند .

محلول های بسته جداسازی DNA ، CTAB :
محلول A ( بافر ( ماده ی جلوگیری از تغییر pH ) استنتاجی CTAB .
CTAB ( ستیل ترمتیلا مونیوم برومید ) (w/v ) 2%
Tris-HCl ( تریسا مینومتان – هیدروکلریک اسید ) ( ۸٫۰ pH ) mM 10
EDTA ( اتیلن دیامین تترا آستیک اسید ) (۸٫۰ pH ) mM 20
NaCl ( سدیم کلرید ) M 1.4

محلول B ( بافر استنتاجی )
Tris-HCl ( تریسا مینومتان – هیدروکلریک اسید ) ( ۸٫۰ pH ) mM100
EDTA ( اتیلن دیامین تترا آستیک اسید ) ( ۸٫۰ pH ) mM100
NaCl ( سدیم کلرید ) mM 250

محلول C ( محلول رسوب CTAB )
CTAB ( ستیل ترمتیلا مونیوم برومید ) (w/v ) 1%
Tris-HCl ( تریسا مینومتان – هیدروکلریک اسید ) (۸٫۰ pH ) mM 50
EDTA ( اتیلن دیامین تترا آستیک اسید ) (۸٫۰ pH ) mM 10

محلول D ( بافر تریس ( TE) با نمک زیاد )
Tris-HCl ( تریسا مینومتان – هیدروکلریک اسید ) (۸٫۰ pH ) mM 10
EDTA ( اتیلن دیامین تترا آستیک اسید ) (۸٫۰ pH ) mM 0.1
NaCl ( سدیم کلرید ) M 100

روش :
برگ های نرم و نورسته (~۱٫۲ g) با وجود نیتروژن مایع بصورت پودر نرمی ، ساییده شدند و بطور برابر در سه لوله میکروفیوج ( ظرفیت ۲٫۰ ml ) تقسیم شدند . خیلی سریع ۰٫۹ ml از محلول مرکاپتواتانول ( v/v ) A + 2% ، ( در دمای ۶۵℃ ) با بافت ترکیب شد ، به این منظور که آن را بطور کامل مرطوب کند . لوله ها در دمای ۶۵℃ به مدت ۱ ساعت با مخلوط کردن گاه به گاه ، بعد از هر ۱۵ دقیقه ، کشت میکروب شدند .
حجم مساوی از کلروفرم : الکل ایزومیل (۲۴:۱ ) به آن اضافه شد . محلول به خوبی با عمل وارونگی به مدت ۷ دقیقه مخلوط شد و سپس در ۸۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شد .
لایه فوقانی آبدار بهبود می یابد . که در آن ، حجم ۱/۱۰th در دمای ۶۵℃ محلول B افزوده شد و این محلول با عمل وارونگی به مدت ۵ دقیقه ترکیب شد . این محلول به همان شیوه با حجم مساوی از کلروفرم : الکل ایزومیل (۲۴:۱ ) بدست آمد و به این ترتیب لایه فوقانی آبدار بهبود می یابد . به این محلول حجم ۱ محلول C افزوده شد . محلول ترکیب شد و در دمای ۶۵℃ به مدت نیم ساعت کشت میکروب شد . این محلول به مدت ۵ دقیقه در ۵۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد . این گویچه ها در میزان ~۵۰۰ محلول D توسط کشت میکروب متناوب در دمای ۶۵℃ ترکیب شدند و در دمای ۴℃ به مدت ۱۵ دقیقه نگهداری شدند . این محلول با سرعت کامل ( ۱۵۰۰۰ دور در دقیقه ) به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شد ، وقتی که گویچه ها با اتانول ۸۰% شسته شدند . گویچه ها هوا خشک شده اند و در نهایت در میزان ۶۰ بافر TE ( تریس ) متوقف شدند و در دمای -۲۰℃ ذخیره شدند .

الکتروفورز ژل آگارز ( حرکت ذرات معلق مایع بوسیله نیروی برق ) .
ژل بارگذاری بافر :
ساکارز (w/v ) 35%
EDTA ( اتیلن دیامین تترا آستیک اسید ) (۸٫۰ pH ) mM 50.0
بروموفنول آبی رنگ (w/v ) 0.2%

بافر TBE (TRIS / BORATE / EDTA )
Tris base ( تریس پایه ) ۵۴ g
اسید بوریک ۲۸ g
EDTA ( اتیلن دیامین تترا آستیک اسید ) ۳٫۸ g
pH بافر در ۸٫۰تنظیم می شود .

الکتروفورز ژل آگارز افقی با استفاده از روش های استاندارد انجام شدند . ۰٫۷% ژل آگارز در بافر ۰٫۵X TBE ایجاد شدند که رنگ اتیدیوم بروماید به آن افزوده شد و در ظرف ژل فشرده شد . نمونه های DNA بعد از اینکه بخوبی با ژل بافر ذخیره گذاری ، دارای بروموفنول آبی رنگ فشرده ، ترکیب شدند ذخیره گذاری شدند و الکتروفورز در ولت ۶۵ انجام شد تا زمانیکه عمل فشرده سازی ۲٫۳^rd طول ژل را بپوشاند . در نهایت نواره های DNA زیر نور فرابنفش مشاهده شدند .

مرحله تحلیل آماری .
همه آزمایش ها یک مرتبه دیگر تکرار شدند و داده های ارائه شده ، میانگین دو مقدار است . میانگین ها و انحراف معیار با استفاده از نرم افزار منشور نموداری ۲۰۰۱ محاسبه شدند .

مرحله عکسبرداری .
عکپس ها با دوربین پنتکس آشای با استفاده از فیلم رنگی ۴۰۰ASA گرفته شدند .

” نتایج ”
آغاز کشت ساقه :
بعد از استریل سازی سطح ریز نمونه های نوک ساقه ، ریز نمونه ها در بطری های کشت ، کشت میکروب شدند . برای کشت میکروب ، ریز نمونه ها به پتری پلیت شیشه ای استریل شده یا پلیت شیشه ای با کمک پنس استریل تحت شرایط ضدّ عفونی دقیق منتقل شدند . در اینجا سپس ریز نمونه ها برش خوردند و برگ های اضافی بیرونی جدا شدند تا آنها اندازه های مناسبی داشته باشند . عمل برش با تیغه برش استریل انجام شد . بعد از برش ریز نمونه ها در اندازه های مناسب ( ۳ -۲ سانتی متر ) ، ریز نمونه ها در بطری های کشت دارای محیط کشت MS با BA ، mg/L 0.2% ، و IBA، mg/L 0.2%، کشت میکروب شدند . بعد از دو هفته مشاهده ، همه ریز نمونه ها کشت بدون آلودگی را ارائه دادند . گیاهان عاری از قارچ و همچنین آلودگی های باکتریایی بودند . ریزنمونه ها بعد از گذشتن دو هفته از کشت ، علائمی از تکثیر را نشان می دهند . جوانه های جدید از گوشه بین برگ های ریز نمونه های ساقه نمایان می شوند و جوانه ها در ۴ هفته ی کشت به ساقه توسعه می یابند . بعد از شروع موفقیت آمیز کشت ( ۲۸ روز کشت ) ، ساقه های به تازگی شکل گرفته بطور جداگانه از ریزنمونه تکثیر شده برداشته شدند و سپس در محیط کشت مشابهی ، کشت شدند تا تعداد ساقه ها برای کار بعدی افزایش یابد .

تکثیر ساقه : ریزنمونه ها علائمی از تکثیر را بعد از گذشت دو هفته از کشت نشان میدهند. جوانه های جدید از گوشه ی بین برگ های ریزنمونه های ساقه نمایان می شوند و جوانه ها در ۴ هفته ی کشت به ساقه توسعه می یابند . ریزساقه ها در محیط کشت اصلی MS با غلظت های متفاوت و ترکیبات BA و Kn ( در ترکیب IBA با میزان mg/L 0.2% ) برای تکثیر ساقه ، کشت میکروب شدند . مشاهده شد که هم BA و هم Kn علائمی از تکثیر ساقه بعد از گذشت دو هفته از کشت میکروب را ارائه دادند .

جدول ۱ : تأثیر ترکیبات متفاوت سیتوکین ها * بر تکثیر ساقه در گیاه آلوئه ورا بعد از گذشت ۴ هفته از کشت .

مشاهده شد که BA، تکثیر ساقه ی بهتری در مقایسه با Kn داشت ( جدول ۱ ) . در محیط کشت دارای BA در غلظت های متفاوت ، بطور میانگین هر ریزنمونه از ۳٫۰ تا ۳٫۳ ساقه افزایش می یابد ( جدول ۱ ، شکل ۳ – ۲ ) . صد در صد کشت ها ، تکثیر ساقه را در محیط کشت دارای BA نشان دادند . در محیط کشت دارای Kn به میزان mg/L 1 ، فقط ۹۰% کشت ها تکثیر ساقه را نشان دادند . در محیط کشت دارای غلظت بیشتری از Kn (mg/L 1.0 ) میزان میانگین ساقه ها در هر گیاه ۱٫۲ ± ۳٫۱ بود . در حالیکه در سویی دیگر در محیط کشت دارای غلظت کمتری از Kn (mg/L 0.2%) میزان میانگین ساقه ها در هر گیاه ۰٫۵ ± ۱٫۴ بود . ریزنمونه هایی که در محیط کشت بدون هیچگونه فیتوهورمون بودند ، قادر به تولید ساقه های جدید نبودند .

( شکل ۲ : کشت میکروب ریزساقه در محیط کشت MS با IBA به میزان mg/L 0.2% + BA به میزان mg/L 1.0 . )

( شکل ۳ : تکثیر ساقه بعد از ۴ هفته از کشت در محیط کشت دارای BA (mg/L 1.0 ) + IBA (mg/L 0.2%) . )
همچنین آدنین سولفات برای کنترل اینکه آیا آن اثری بر تکثیر ساقه دارد یا نه ، نیز بکار برده شد . مشاهده شد که آدنین سولفات هیچگونه اثر مهمی بر تکثیر ساقه در گیاه آلوئه ورا ندارد .

جدول ۲ : تأثیر آدنین سولفات* بر تکثیر ساقه در گیاه آلوئه ورا بعد از ۴ هفته از کشت .

در هر دو مورد یعنی با آدنین سولفات و هم بدون آدنین سولفات ، میزان میانگین ساقه ها در هر گیاه ۳٫۱ بود ( جدول ۲ ) . درصد ریز نمونه ای که تکثیر ساقه را نشان می دهد نیز کمتر از سطح کنترل یعنی ۲۹ ± ۷۵ بود .
مشاهده شد که اسید سیتریک در افزایش تکثیر ساقه نقش مطلئبی داشته است . میزان میانگین ساقه ها در محیط کشت با mg/L 10 اسید سیتریک ، ۱٫۹ ± ۵٫۰ بود ( جدول ۳ ) . همه ریزنمونه ها واکنش ترکیب ساقه را در همه آزمایشات نشان دادند ، در حالیکه در محیط کشت بدون اسید سیتریک ، میزان میانگین ساقه ها ۰٫۹ ± ۳٫۳ بود . غلظت بیشتر اسید سیتریک (mg/L 100 ) حالت ترویجی کمتری داشت .

جدول ۳ : تأثیر اسید سیتریک* بر تکثیر ساقه در گیاه آلوئه ورا بعد از ۴ هفته از کشت .

برای کنترل اینکه آیا تفاوتی بین محیط کشت جامد و مایع در تکثیر ساقه در گیاه آلوئه ورا وجود دارد یا نه ، هر دو محیط کشت جامد و مایع مورد آزمایش قرار گرفتند . مشاهده شد که در محیط کشت مایع ، تکثیر ساقه بهتر بود . میزان میانگین ساقه ها در محیط کشت مایع ۲٫۵ ± ۴٫۸۰ بود در حالیکه در محیط کشت مایع ، میزان میانگین ساقه ها ۲٫۰ ± ۴٫۰۸ بود . ( جدول ۴ ) . رشد کشت ها در محیط مایع در مقایسه با محیط کشت جامد سریعتر بود .
جدول ۴ : تأثیر محیط کشت مایع و جامد بر تکثیر ساقه در گیاه آلوئه ورا بعد از ۴ هفته از کشت .

ریشه زایی ریزساقه ها :
ساقه های به طول سه تا چهار سانتی متر بطور جداگانه از دسته های ساقه تکثیر شده برش خوردند و در محیط کشت ریشه زایی کشت شدند . ساقه های کشت میکروب شده در محیط کشت بدون هورمون ( محیط بدون IBA ) و محیط تکمیلی IBA ، واکنش ریشه زایی را در طیّ یک هفته عمل کشت میکروب نشان دادند . با اینحال واکنش در محیط کشت بدون هورمون بهتر بود . بعد از ۱۵ روز از کشت میکروب ، ریشه زایی در محیط بدون هورمون ۱۰۰% بود ( جدول ۵ – شکل ۵ – ۴ ) . تعداد ریشه ها در هر ساقه در محیط کشت بدون هورمون ۰٫۵ ± ۲٫۸ بود .

( شکل ۴ : ریز ساقه ها بعد از گذشت ۱۵ روز از کشت ، ریشه زایی را نشان می دهند . )

( شکل ۵ : یک ریزساقه ریشه دار . )
جدول ۵ : تأثیر IBA بر القاء گیاه آلوئه ورا بعد از گذشت ۱۵ روز از کشت .

در محیط کشت بدون هورمون ، ریشه ها ضخیم و باریک بودند در حالیکه ریشه ها در محیط تکمیلی هورمون ، نازک بودند و باریکی کمتری داشتند . هیچگونه تفاوتی در رنگ ریشه ها نبود . در هر دو مورد ، رنگ ریشه ها زرد مایل به کرمی بود . در هر دو مورد ریشه ها بدون هیچگونه شاخه ای بودند و ظاهری طبیعی داشتند . در محیط کشت بدون هورمون ، تعداد میانگین ریشه ها در هر گیاه ۰٫۵ ± ۲٫۸ و در محیط تکمیلی هورمونی ، تعداد میانگین ریشه ها در هر گیاه ۱٫۱ ± ۱٫۷ بود .
بمنظور منترل تأثیر محیط کشت جامد و مایع بر روی القاء ریشه بطوریکه واکنش ریشه زایی قابل بهبود و یا هزینه ی گیاهان تولید شده قابل کاهش باشد ، ریز ساقه ها در رهر دو محیط کشت میکروب شدند . ریزساقه های کشت میکروب شده در محیط کشت جامد ، واکنش ریشه زایی بهتری را نشان دادند .
جدول ۶ : تأثیر محیط کشت جامد و مایع بر القاء ریشه گیاه آلوئه ورا بعد از ۱۵ روز از کشت .

صد در صد ساقه ریشه زایی رانشان دادند و میزان میانگین ریشه ها در هر ساقه ۲٫۷±۱٫۲ بود ( جدول ۶ ) . از سویی دیگر در محیط کشت مایع ، فقط میزان ۱۸%±۲۰٫ ریز ساقه ، ریشه زایی را نشان دادند . ساقه های کشت میکروب شده در محیط کشت مایع هیچگونه واکنش ریشه زایی را حتی بعد از ۴ – ۳ هفته از کشت میکروب نداشتند . ( اطلاعاتی نشان داده نشد . )

مرحله سفت شدگی گیاهچه ها :
بعد از ۱۵ روز از کشت ریز ساقه ها در محیط کشت ریشه زایی ، که منجر به ریشه زایی کافی ساقه ها شد ، گیاهچه ها به گلدان های پلاستیکی دارای خاک باغ و کود دامی ( ۱:۱) برای سفت شدگی آنها منتقل شدند . در ده روز اول ، گیاهچه ها در گلخانه نگه داشته شدند . برای حفظ سطح رطوبت مناسب ( ۸۰% ) ، گیاهان بطور کامل با کمک آب پاش دستی به مدت ۲ ساعت آب دهی شدند . دمای گلخانه در دمای ۳۱℃ با سطح رطوبت حدود ۸۰% حفظ شده بود .
جدول ۷ : میزان ماندگاری گیاهچه های آلوئه ورا در مراحل مختلف سفت شدکی .

گیاهچه هایی که در گلخانه به گلدان های پلاستیکی منتقل شدند ، درصد مناسبی از ماندگاری ۸۵% را نشان دادند ( جدول ۷ – شکل ۶ ) . بعد از نگهداری گیاهچه ها در ده روز اول در گلخانه ، گیاهچه ها به سایه خانه که دارای رطوبت کمتر و شرایط دمایی کنترل شده و نور خورشید غیر مستقیم می باشد، منتقل شدند . در سایه خانه ، این گیاهان درصد ۸۲% ماندگاری را نشان دادند . ( جدول ۷ ) . در سایه خانه ، گیاهان دو مرتبه در روز یعنی صبح و عصر آب دهی شدند . در میان گیاهان ماندگار ، برخی از گیاهان علائم بافت مردگی را در طیّ شرایط سایه خانه نشان دادند . اما این امر ، رشد کلی گیاهان را مختل نمی کند . گیاهان با وجود ای نعلائم هم بخوبی رشد می کردند .

( شکل ۶ : گیاهان سفت شده ی کامل در سایه باز رشد می کنند . )

ساختار گیاهانی با تکثیر مجدّد .
همه گیاهان تولید شده از نظر ساختار مشابه به گیاهان اصلی / مادر بودند . برای یافتن هر گونه تغییرات مخرّب گیاه ( اگر باشد ) ، که در سطح مولکولی / سطح DNA رخ داده است ، DNA ژنومیک گیاهان کنترل و گیاهان کشت بافت جدا شدند . بنابراین ، DNA جدا شده برای یافتن هرگونه تغییر احتمالی مخرّب گیاهی بکار رفت . الکتروفورز ژل آگاروز نشان داد که همه این نمونه ها ، وقتی که با علائم اندازه مولکولی مقایسه شدند ، حدود kb23 بودند ( شکل ۸ ) . کار بعدی با عامل جدا شده در حال توسعه است .

جدول ۸ : کمیّت گذاری DNA جدا شده توسط روشهای اسپکتروفوتومتریک فرابنفش .

( شکل ۷ : نمایه ژل DNA آلوئه ورا . )
مسیر ۱ : DNA ژنوم طبیعی گیاه . مسیر ۲ : DNA ژنوم طبیعی گیاه . مسیر ۳ : DNA ژنوم گیاهی کشت بافت . مسیر ۴ : ژنوم گیاهی کشت بافت . مسیر ۵ : DNA ژنوم طبیعی گیاه . مسیر ۶ : ۶: λ-Hind^222 DNA .

” مباحثه ”
برای تکثیر ساقه ، تنظیم کننده های رشد مخصوصاً سیتوکین ها ( لین ۱۹۷۹ ، استولز ۱۹۷۹، بوجوانی ۱۹۸۰، گارلند و استولز ۱۹۸۱ ) یکی از مهمترین عوامل موثر بر واکنش هستند . گستره ای از سیتوکین ها ( کینتین ، BA، ۲-ip، و زینین ) در امر افزایش تدریجی بکار رفته اند ( بوجوانی و رازدان ۱۹۹۲ ). موراشیگ ( ۱۹۷۴ ) و هاسی ( ۱۹۷۸) ۲-ip را موثرتر از BA و یا کینتین توصیف می کنند . برخی گیاهان مانند گیاه زغال اخته ( کوهن ۱۹۸۰ ) و گیاه سیر ( بوجوانی ۱۹۸۰ ) با استفاده از ۲-ip با موفقیت تکثیر یافتند . اما بررسی گسترده ای در مورد مقاله فعلی پیشنهاد می کند که BA معتبرترین و کاربردی ترین سیتوکین است . تعدادی از گیاهان با موفقیت در محیط کشت دارای BA تکثیر شدند . در گیاه شبدر سفید ( بوجوانی ۱۹۸۱ ) و گیاه بید پیوندی ( بوجوانی ۱۹۸۰ ) ، گیاه نخود ( بارنا و واخلو ۱۹۹۴ ) گروه نیر ( ۱۹۷۹ ) و گیاه ایرسین ایندنی ( سباستین و بارنا ۲۰۰۳ ) یافتند که BA موثرترین سیتوکین برای نوک ساقه ، بافت نارس و کشت جوانه است . در سطوح بالاتر ، سیتوکین ها تمایل به القاء ساختار نابجای جوانه ( مک کومب ۱۹۷۸ ، زیمرمن و بروم ۱۹۸۰ ) دارند . همچنین در این تحقیق ، تکثیر ساقه فقط با وجود سیتوکین رخ داد . در میان سیتوکین های آزمایش شده ، به من ثابت شد که BA موثرتر است . این حالت در مقابل گزارش های قبلی در خصوص آلوئه ورا توسط میر و استادن ( ۱۹۹۱ ) و گروه ناتالی ( ۱۹۹۰ ) در خصوص آلوئه ورا می باشد . این پژوهشگران گزارش دادند که تکثیر بهتری در محیط کشت دارای Kn به جای BA در گیاه آلوئه ورا رخ داده است . این اختلاف ممکن است ناشی از تفاوت در نماد ژنی گیاه کاربردی باشد . آبری و استادن ( ۲۰۰۱) ، چادهوری و موکاندان ( ۲۰۰۰) هم کاربرد BA در تکثیر ساقه ی گیاه پلی فیلا آلوئه و آلوئه ورا را گزارش دادند .
آدنین سولفات هم برای کنترل تأثیر آن بر تکثیر ساقه بکار رفت . در تحقیق ما ، آدنین سولفات تکثیر ساقه را در گیاه آلوئه ورا را بهبود نداد . اما آدنین سولفات قبلی برای تکثیر ساقه در گیاه آلوئه ورا توسط چادهوری و موکاندان ( ۲۰۰۱) بکار رفتند .
همچنین اسید سیتریک در تکثیر ساقه ی افزایش یافته در آلوئه ورا در این تحقیق کمک کرد . با در نظر گرفتن عامل هزینه آگار ، محیط کشت مایع نیز برای تکثیر ساقه در آلوئه ورا بکار برده شد . در این تحقیق ، محیط کشت مایع برای تکثیر ساقه در آلوئه ورا به نظر بهتر رسید . کاربرد محیط کشت مایع بطور قابل توجهی ، هزینه گیاهان تولیدی برای اهداف تجاری را کاهش می دهد .
گزارش شد که واکنش ریشه زایی ریز ساقه ها توسط رشد تنظیم کننده ها در محیط کشت ( بوجوانی و رازدان ۱۹۹۲ ) ، ترکیب نمک پایه ( گارلند و استولتز ۱۹۸۱ ، زیمرمن و بروم ۱۹۸۱، اسکیروین و چو ۱۹۷۹ ) ، نماد ژنی ( رینز و مک کوی ۱۹۸۱ ) همانند شرایط کشت ( موراشیگ ۱۹۷۷ ) قابل کنترل است . برای اکثر گونه ها ، اکسین بمنظور القاء ریشه مورد نیاز است . NAA و IBA رایجترین عوامل کاربردی برای القاء ریشه هستند . ( بوجوانی و رازدان ۱۹۹۲ ) . با کاربرد IBA ، بسیاری از گیاهان مانند اسکولمتوم لیکوپرسیکون(نوعی گیاه گوجه) ( سیبی ۱۹۸۲ ) ، راکسبرگی هدیچیوم ( تریپاتی و بیتایلیون ۱۹۸۵ ) ، کارناشن ( ورکر و لشم ۱۹۸۷ ) ریشه زایی آزمایشگاهی راارائه دادند. برای هدف القاء ریشه ها ، محیط کشت تکمیلی IBA و بدون هورمون ، در این تحقیق بکار رفتند . اما مشاهده شد که ریشه زایی در محیط کشت بدون هورمون بهتر است . همچنین این انواع مشاهدات قبلاً توسط سانچز و گروهش ( ۱۹۸۸ ) ، میر و استادن ( ۱۹۹۱ ) و گروه ریچواین ( ۱۹۹۵ ) در خصوص گیاه آلوئه ورا انجام شده بودند . همچنین گروه ریچواین ( ۱۹۹۵ ) القاء ریشه ها در محیط کشت هورمونی را برای برخی گیاهان مانند گاستریا و هاورتیا گزارش دادند . بیشتر گیاهان مانند گیاه توت فرنگی ( باکسوس ۱۹۷۴ ) ، گیاه نرگس ( گروه سیبروک ۱۹۷۶ )، گیاه زنیق ( هاسی ۱۹۷۹ ) و گل سرخ ( بارنا و واخلو ۱۹۹۵ ) با موفقیت در محیط کشت بدون هورمون ریشه زایی شدند.
کاهش در تعداد ریشه ها در محیط کشت تکمیلی IBA ممکن است ناشی از غلظت ایجاد شده IBA در محیط کشت باشد . با در نظر گرفتن عامل هزینه ، سعی شده است تا محیط کشت مایع برای القاء ریشه ها بکار روند . اما ریشه زایی در محیط کشت مایع در این تحقیق ضعیف است . سفت شدگی گیاهان کشت بافت ، بحرانی ترین مرحله در تکثیر تدریجی است . گیاهان تولیدی برای برخورد با شرایط محیطی محدود، خیلی نرم و هموار هستند (بوجوانی و رازدان ۱۹۹۲ ) . این گیاهان تحت شرایط کنترل شده رشد می کنند . تحت این شرایط، برگ های گیاهان ، پوششان گسترش می یابد و سیستم فتوسنتزی آنها شروع به عملکرد می کند . بحرانی ترین مرحله در مدت ده روز در گلخانه است . در مدت مرحله دوم سفت شدگی، ضایعات کمتر است زیرا که گیاهان بطور تطابقی در مدت مرحله اول سفت شدگی و یا در مدت ده روز اول در گلخانه سفت شده اند .
در این مطالعه گیاهچه های ریشه دار ، از بطری های کشت به ظرفهای کوچک پلاستیکی، که دارای ترکیبی از نسبت ۱:۱ خاک : FYM برای سفت شدگی آنها قبل از انتقال اولیه آنها به خاک، منتقل می شوند که این حالت درصد مناسبی از ماندگاری ( ۸۵%) را در گلخانه و سایه خانه نشان داد . همچنین در سایه خانه ، گیاهان میزان ماندگاری ۸۲% را نشان دادند. عوامل رشد و باریکی گیاهان در گلخانه کمتر بود در حالیکه در سایه خانه رشد گیاهان بهتر بود و همچنین آنها در سایه خانه حالتی ممند می یافتند . برگ ها هم در سایه خانه ضخامت داشتند .

” نتیجه گیری”
گیاه آلوئه ورا یک گیاه خشک زی دارویی است که دارای اهمیت زیای می باشد . این گیاه در صنعت دارو و لوازم آرایشی و بهداشتی بطور گسترده ای کاربرد دارد و تقاضای آن روز به روز افزایش می یابد . بعلت عامل سترونی گامت نر ، این گیاه فقط از طریق تکثیر مجدد حالت گیاهی گسترش می یابد . اما سرعت میزان گسترش آن برای برآورد تقاضای تجاری با مواد کشت با کیفیت بالا برای کشت تجاری آن بسیار آرام است . از اینرو با در نظر گرفتن این عامل ، عمل تکثیر تدریجی بر روی گیاه انجام می گیرد . اهداف این تحقیق، استاندارد سازی شرایط مطلوب برای ایجاد کشت بدون آلودگی از گیاه نارس ، تکثیر ساقه، ریشه زایی ریز ساقه ها، سفت شدگی و انتقال گیاه به خاک می باشد . بمنظور تعیین هرگونه تغییرات احتمالی مخرّب گیاهی، علاوه بر مقایسه آنها بر حسب ساختار، ما انجام تعدادی تحلیل ژنتیکی را هم طرح ریزی کرده ایم . برای این هدف، ما DNA را از گیاهان طبیعی و همچنین از گیاهانی که از طریق کشت بافت ایجاد شده بودند ، جدا کردیم . اما به علت کمبود وقت ، ما قادر بودیم تا فقط بخش اول کار را تکمیل کنیم .
نتایج برگرفته از این تحقیق عبارتند از :
۱ ) استریل سازی سطح با کلرید جیوه ( ۰٫۱% به مدت ۵ دقیقه ) با ۷۰% ترکیب الکل، برای استریل سازی سطح ریزنمونه ها بهترین حالت بود .
۲ ) برای شروع کشت، محیط کشت MS ( موراشیگ و اسکوگ ) با BA ( به میزان mg/L 0.2) و IBA ( به میزان mg/L 0.2 ) بکار رفتند .
۳ ) بهترین تکثیر ساقه در محیط کشت MS دارای BA (mg/L 1.0 ) و IBA (mg/L 0.2 ) بدست آمد .
۴ ) محیط کشت مایع با ترکیب مشابه بهتر از محیط کشت جامد برای تکثیر ساقه بود .
۵ ) آدنین سولفات تکثیر ساقه را در این تحقیق توسعه نداد .
۶ ) افزایش mg/L 10 اسید سیتریک در محیط کشت در افزایش تکثیر ساقه نقش موثری دارد. اسید سیتریک در غلظت بیشتر ( mg/L 100 )تأثیر کمتری داشت .
۷) صد در صد ساقه، واکنش ریشه زایی را در محیط کشت بدون هورمون نشان داد .
۸ ) در محیط کشت مایع ، واکنش ریشه زایی بسیار ضعیف دیده شد .
۹ ) گیاهچه های دوباره تولید شده ، ماندگاری ۸۵% در مدت شرایط گلخانه ای و ۸۲% در مدت مرحله سفت شدگی سایه خانه داشتند .
۱۰ ) گیاهان دوباره تولید شده از نظر ساختاری مشابه به گیاهان کنترل / مادر بودند .

 

من سامان نصیری نویسنده این مقاله هستم.

تاریخ انتشار: 3 سپتامبر 2020
45 بازدید

مطالب مرتبط

دیدگاه ها

مجوزها و نمادها


logo-samandehi

پل های ارتباطی با ما …

تبریز ، بخش مقصودیه ، خیابان ارتش جنوبی، کوچه شهید شهابی ، بن بست باغچه ، پلاک ۸۷ ، طبقه 4
تلفن تماس : 04135421108-09307584802
ایمیل : entofa@gmail.com


Unit4,No87,Baghcheh Alley,South Artesh ST,Azadi ave,MAGHSUDIYEH, Tabriz, Iran
کلیه حقوق این وب سایت محفوظ می باشد . طراحی و توسعه آلسن وب    All rights reserved © 2020 Entofa